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August 1, 2021

Revelando la arquitectura funcional de la enzima a través de la cinética de enzimas microfluídicas de alto rendimiento

Ve a lo grande o te perderás

La mutagénesis racional es un enfoque común para investigar o modificar la función enzimática in vitro, pero la facilidad con la que se pueden manipular las secuencias de proteínas oculta muchas trampas al conectar los datos de actividad escasos con el verdadero panorama funcional de una enzima. Usando una plataforma de alto rendimiento, Markin et al. expresó, purificó y realizó una serie de medidas cinéticas en una esterasa diana, recopilando datos de> 1000 mutaciones que abarcan toda la proteína (ver Perspectiva de Baumer y Whitehead). El plegamiento incorrecto de la proteína en un estado inactivo, en lugar de una estabilidad de equilibrio disminuida, fue un factor crucial en las variantes afectadas negativamente que se extendieron por toda la proteína. Cuando se combinan con estructuras y conocimientos mecanicistas previos, cuatro “componentes funcionales” ayudan a racionalizar el patrón espacial, de otro modo complejo, de los efectos de las mutaciones en diferentes aspectos de la función enzimática, todos los cuales serían invisibles a partir de la mutagénesis de unos pocos residuos.

Ciencias, abf8761, este número p. eabf8761; véase también abj8346, pág. 391

Resumen estructurado

INTRODUCCIÓN

Las enzimas poseen una extraordinaria capacidad catalítica y especificidad. En última instancia, estas propiedades derivan de interacciones no solo entre los residuos del sitio activo y el sustrato, sino también de interacciones funcionales a través de una enzima plegada. Por lo tanto, comprender los orígenes de la competencia y la especificidad catalíticas requerirá la capacidad de realizar mutaciones en toda la proteína. Tradicionalmente, los sitios activos enzimáticos se han caracterizado por medio de mutagénesis dirigida al sitio (SDM), revelando mucho sobre las funciones catalíticas de estos residuos; sin embargo, SDM es de bajo rendimiento, costoso y requiere mucha mano de obra. Por el contrario, las técnicas de escaneo mutacional de alto rendimiento desarrolladas recientemente analizan un gran número de secuencias pero proporcionan solo estimaciones aproximadas de la función, como la cantidad de producto generado en un momento particular bajo un conjunto particular de condiciones o aptitud general del organismo.

RAZÓN FUNDAMENTAL

Se necesitan nuevas tecnologías para superar las limitaciones de los enfoques actuales y permitir una caracterización profunda de muchas variantes de enzimas de una manera rentable y eficiente en el tiempo. Para enfrentar este desafío, desarrollamos una plataforma de microfluidos de alto rendimiento que permite la expresión y purificación simultáneas de más de 1500 mutantes enzimáticos elegidos racionalmente en horas y permite su caracterización funcional cuantitativa en días. HT-MEK (cinética de enzimas microfluídicas de alto rendimiento) se puede utilizar con cualquier sistema enzimático que pueda etiquetarse y expresarse in vitro y tenga un ensayo fluorogénico directo o acoplado.

RESULTADOS

Como primera aplicación de HT-MEK, caracterizamos funcionalmente 1036 mutantes de sitio único que contienen una sustitución de glicina o valina en cada posición dentro de PafA (fosfatasa alcalina irreprimible de fosfato de Flavobacterium), una enzima bien estudiada de la superfamilia de la fosfatasa alcalina . Para cada mutante, medimos la cinética de Michaelis-Menten [apparent unimolecular rate constant (kcat), Michaelis constant (Km), and kcat/Km] para múltiples sustratos, constantes de inhibición y efectos sobre el plegado, obteniendo más de 5000 constantes cinéticas y termodinámicas de más de 670.000 reacciones totales. Encontramos que la mayoría de las mutaciones (702 de 1036) produjeron efectos estadísticamente significativos en algún aspecto de la catálisis. Mediante la variación sistemática e independiente de las condiciones de expresión y ensayo, determinamos que 232 de estas mutaciones redujeron la catálisis al promover la formación de un estado de plegado incorrecto catalíticamente inactivo de larga duración, mientras que ninguna lo hizo mediante el desarrollo del equilibrio en las condiciones de nuestro ensayo. La combinación de estas medidas funcionales con el conocimiento mecanicista previo nos permitió evaluar sistemáticamente el efecto de cada mutación. Diferentes grupos de residuos afectaron diferentes aspectos de la función, con residuos que afectan una función particular formando grandes regiones espacialmente contiguas que se extendían desde el sitio activo hasta 20 Å desde el sitio activo y hasta la superficie de la enzima.

CONCLUSIÓN

HT-MEK nos ha permitido descubrir efectos funcionales a lo largo de PafA e identificar las características catalíticas afectadas por diferentes grupos de residuos. Algunos de estos efectos se racionalizan fácilmente mediante la inspección de las interconexiones estructurales con el sitio activo, mientras que otros no eran obvios, incluidos grandes efectos distales y superficiales y el descubrimiento de un estado de plegado incorrecto de larga duración. Estos resultados subrayan la necesidad de medir los efectos de las mutaciones en múltiples parámetros cinéticos y termodinámicos en múltiples condiciones de reacción y, por lo tanto, la necesidad de esta nueva tecnología. Debido a que HT-MEK es aplicable a cualquier enzima con una lectura fluorescente directa o acoplada y proporciona un análisis cuantitativo y en profundidad del espacio mutante rápidamente y a un costo modesto, puede ser el método de elección para caracterizar nuevas enzimas. En aplicaciones futuras, HT-MEK se puede utilizar para diseccionar trayectorias evolutivas potenciales, determinar las consecuencias funcionales de las variantes alélicas asociadas a enfermedades humanas, identificar superficies con potencial alostérico naciente para el control racional de la catálisis y dirigir la adaptación de enzimas naturales y diseñadas para nuevas funciones y roles.

La expresión, purificación y caracterización bioquímica simultáneas de variantes enzimáticas en un dispositivo de microfluidos permite medir los parámetros de Michaelis-Menten y las constantes de inhibición para más de 1500 variantes en días.

Los efectos mutacionales en múltiples ensayos revelan una amplia arquitectura funcional en la que regiones de residuos físicamente contiguas que se extienden hasta la superficie de la enzima controlan o alteran aspectos particulares de la catálisis.

Abstracto

Se necesita una investigación sistemática y extensa de las enzimas para comprender su extraordinaria eficiencia y enfrentar los desafíos actuales en medicina e ingeniería. Presentamos HT-MEK (Cinética de enzimas microfluídicas de alto rendimiento), una plataforma de microfluidos para la expresión, purificación y caracterización de alto rendimiento de más de 1500 variantes de enzimas por experimento. Para 1036 mutantes de la fosfatasa alcalina PafA (fosfatasa alcalina irreprimible de fosfato de Flavobacterium), realizamos más de 670.000 reacciones y determinamos más de 5000 constantes cinéticas y físicas para múltiples sustratos e inhibidores. Descubrimos una amplia partición cinética a un estado de plegado incorrecto y efectos catalíticos aislados, revelando regiones espacialmente contiguas de residuos vinculados a aspectos particulares de la función. Las regiones incluían residuos proximales del sitio activo pero se extendían hasta la superficie de la enzima, lo que proporciona un mapa de la arquitectura subyacente que no es posible derivar de los enfoques existentes. HT-MEK tiene aplicaciones que van desde la comprensión de los mecanismos moleculares hasta la medicina, la ingeniería y el diseño.