December 8, 2021

Manipulación de circuitos neuronales, en concierto

La percepción y el comportamiento surgen de la actividad coordinada y orquestada de las neuronas en los circuitos cerebrales. Las neuronas individuales y funcionalmente coherentes forman conjuntos, que se convierten en los componentes básicos de los circuitos a gran escala para impulsar la maquinaria cerebral (1). La capacidad de modular la actividad cerebral en un patrón espacio-temporal con alta especificidad (escala de tiempo de milisegundos y resolución celular) tiene grandes implicaciones para interactuar con esta sofisticada maquinaria. En la ciencia fundamental, proporciona una herramienta poderosa para diseccionar circuitos neuronales con gran detalle y estudiar la causalidad entre la actividad neuronal, la dinámica de los circuitos y el comportamiento (26). En la medicina traslacional, juega un papel importante en el tratamiento de trastornos cerebrales (7, 8) y promete convertirse en una nueva herramienta para la medicina de precisión.

La estimulación eléctrica es el método más maduro para modular la actividad cerebral. Sin embargo, los electrodos penetrantes son muy invasivos y hay una falta de especificidad espacial en las regiones cerebrales objetivo. Por lo tanto, las neuronas en un gran volumen cerebral se estimulan de forma indiscriminada de forma simultánea, independientemente de su función individual en el circuito cerebral y del vínculo resultante con la conducta. Esta baja especificidad espacial y los efectos asociados inespecíficos fuera del objetivo no solo limitan la aplicación de estos enfoques en el estudio de los circuitos cerebrales, sino que también plantean preocupaciones con respecto a la eficacia general y los efectos secundarios en la terapia clínica (9, 10).

Los métodos ópticos, particularmente cuando se combinan con optogenética (11, 12), ofrecen un nuevo enfoque para modular la actividad cerebral con especificidad de tipo celular. Aunque se puede lograr una alta especificidad espacial en muestras bidimensionales (2D), como cortes delgados de cerebro, el uso temprano de la optogenética en cerebros vivos enfrentó los mismos desafíos que la estimulación eléctrica: la luz dispersa no pudo distinguir las células individuales en un volumen 3D y en su lugar, estimuló todas las neuronas juntas. La luz de dos fotones resuelve el problema de la especificidad espacial y logra una resolución celular. Tomando prestada esta técnica de la microscopía de barrido láser, la optogenética de dos fotones estimula secuencialmente las neuronas una por una (13, 14). Aunque la especificidad es alta, la estimulación secuencial unicelular no logra imitar los patrones de actividad intrínseca en el cerebro, donde múltiples neuronas pueden disparar potenciales de acción simultáneamente.

Hablando metafóricamente, manipular neuronas en un circuito es similar a presionar las teclas de un teclado de piano. Fotoestimular las neuronas de una en una es como tocar el piano con un solo dedo, lo que no produciría una pieza de concierto rítmica y melodiosa. Para modular la actividad neuronal de manera coordinada, es necesario estimular simultáneamente un conjunto de neuronas, distribuidas en un volumen cerebral tridimensional, con resolución celular, como si se tocara el piano con los 10 dedos. Somos de los primeros en abordar este desafío in vivo (15) y demostrar el poder de la optogenética en el estudio del vínculo entre la actividad neuronal y el comportamiento (2) (ver la figura).

Optogenética holográfica de dos fotones

Aprovechando el holograma generado por computadora, codificamos la información espacial 3D de las neuronas objetivo en el holograma de fase utilizando un modulador de luz espacial, para desarrollar técnicas holográficas 3D de dos fotones para optogenética de precisión (15). Al proyectar un patrón de luz holográfica, que contiene haces enfocados en las neuronas objetivo en el cerebro de un ratón, podemos modular con precisión la actividad de los conjuntos neuronales. La excitación de dos fotones asegura que la luz pueda penetrar profundamente en el tejido de dispersión y estimular las neuronas diana distribuidas en un volumen 3D con excelente especificidad. Para maximizar el número de neuronas que se pueden estimular a la vez sin imponer altas dosis de luz (y por lo tanto calor) en el cerebro, aumentamos la eficiencia de excitación de dos fotones adaptando un láser de femtosegundos de baja tasa de repetición. Esto nos permitió estimular simultáneamente un gran grupo de neuronas (> 50) con una cantidad mínima de energía lumínica (unos pocos milivatios por neurona). Al cambiar rápidamente los hologramas (escala de tiempo de milisegundos), podemos estimular diferentes grupos de neuronas con alta especificidad temporal. Nuestro enfoque de optogenética holográfica de dos fotones permite modular la actividad neuronal en un patrón espacio-temporal deseado.

Interrogación totalmente óptica de la actividad neuronal

Para manipular de manera experta los circuitos cerebrales, necesitábamos un mapa neuronal 3D. Construimos un microscopio de ruta dual con dos láseres diferentes, integrando imágenes de calcio volumétricas de alta velocidad de dos fotones con optogenética holográfica de dos fotones (15). La ruta de imágenes estaba equipada con una lente sintonizable eléctricamente para obtener imágenes 3D rápidas (15, dieciséis), y la ruta optogenética se equipó con un modulador de luz espacial para generar el patrón de fotoestimulación 3D. Para evitar la interferencia entre la imagenología y la optogenética, seleccionamos indicadores y opsinas con distintos espectros de excitación de luz: indicador de calcio GCaMP6 (17) para imágenes y opsina C1V1 (18) para optogenética. Utilizando este microscopio de doble ruta, fuimos de los primeros en demostrar imágenes 3D simultáneas y fotoestimulación holográfica de la actividad cortical en ratones despiertos (ver figura). Esta configuración totalmente óptica nos permitió estimular con precisión un grupo arbitrario de neuronas mientras monitoreamos la respuesta del circuito y, por lo tanto, permitió el control de circuito cerrado de la actividad cerebral, todo con alta especificidad temporal y resolución celular en un gran volumen cerebral 3D.

Optogenética holográfica de dos fotones

(A) Esquemas de imágenes de calcio volumétricas simultáneas de dos fotones y fotoestimulación con patrones holográficos 3D de dos fotones en un cerebro de ratón. Un grupo de neuronas definido por el usuario puede estimularse simultáneamente con una alta especificidad espacio-temporal. (B) Control en circuito cerrado de la actividad y el comportamiento neuronales. El circuito neuronal captado durante el comportamiento animal proporciona un mapa para modular el cerebro a través de la optogenética holográfica de dos fotones. Demostramos que el rendimiento del ratón en una tarea de discriminación visual Go / No-Go puede mejorarse fotoactivando solo dos neuronas del conjunto central en la corteza visual (2).

GRÁFICO: H. OBISPO /CIENCIA BASADO EN W. YANG

Modulación del comportamiento activando la actividad del conjunto neuronal

Comprender el papel de los conjuntos neuronales podría conducir a una nueva comprensión de cómo surgen los comportamientos, así como a terapias innovadoras para las enfermedades cerebrales (8). Usando nuestro método alóptico, estudiamos el vínculo causal entre la actividad y el comportamiento del conjunto y demostramos un enfoque eficiente para modular el comportamiento (2) (ver la figura).

Diseñamos una tarea de discriminación visual Go / No-Go, en la que se mostraban aleatoriamente dos orientaciones de rejillas a la deriva y el ratón discriminaba entre ellas lamiendo una tromba de agua. Presumimos que la modulación de la actividad del conjunto podría afectar el comportamiento. Holográficamente fotoactivamos un grupo aleatorio de neuronas inespecíficas en la corteza visual del ratón durante la tarea. Como era de esperar, el “ruido” resultante en la corteza visual disminuyó el rendimiento de la tarea. Luego preguntamos si la modulación neuronal dirigida podría mejorar el resultado de la tarea. Utilizando un algoritmo de aprendizaje automático, extrajimos los conjuntos neuronales y las neuronas del conjunto central relacionadas con el “Go-cue” de los estímulos visuales en la corteza visual. Sorprendentemente, la fotoactivación holográfica de solo dos neuronas del conjunto central durante el Go-cue podría mejorar el rendimiento de la tarea (2).

A través de imágenes, observamos que la activación de las neuronas del conjunto central impulsó el reclutamiento generalizado de otras neuronas dentro del conjunto. Tal mecanismo de finalización de patrones, que potencialmente involucra redes neuronales recurrentes, eventualmente amplificó el efecto de activación de las neuronas del conjunto central y finalmente moduló el resultado conductual. Este efecto fue tan pronunciado que la activación holográfica podría provocar el lamido del ratón asociado con el Go-cue incluso cuando el Go-cue no se presentó físicamente (2).

En comparación con los enfoques anteriores en los que se estimulan grandes regiones del cerebro a la vez, ya sea eléctricamente o mediante optogenética de fotón único, nuestro enfoque holográfico proporciona una especificidad y eficiencia mucho mayores. Nuestro estudio no solo demuestra la relevancia funcional y conductual de los conjuntos neuronales y proporciona una ilustración directa de la finalización del patrón, sino que la capacidad de escribir información con precisión en el cerebro para desencadenar el comportamiento abre una nueva vía en la medicina de precisión para corregir la fisiopatología de los trastornos mentales. (8).

Una perspectiva de la optogenética de precisión

La invención de la optogenética ha proporcionado a los neurocientíficos una nueva herramienta para modular la actividad neuronal específica del tipo de célula. Nuestra técnica de holografía de dos fotones in vivo ha llevado la optogenética a una nueva era de precisión. Hoy y en el futuro cercano, los patrones de modulación espacio-temporal 4D, que son paralelos a la fisiología intrínseca del sistema neural, podrían aplicarse para provocar actividad recurrente y reclutar actividad y comportamiento aguas abajo.

Hemos demostrado la activación de un comportamiento guiado visualmente a través de la optogenética holográfica de dos fotones en la corteza visual del ratón (2), y otros han aplicado esta técnica al hipocampo del ratón (4), para impulsar el comportamiento espacial. En otros modelos animales como las larvas de pez cebra (6), el método se ha utilizado para provocar el comportamiento motor. En cada caso, la activación de solo un pequeño número de neuronas pudo modular el comportamiento animal.

Además de estudiar la causalidad del circuito, la optogenética holográfica de dos fotones es una herramienta ideal para inducir la plasticidad de la red a través de la plasticidad hebbiana (19). Al fotoestimular repetidamente un grupo de neuronas, demostramos que la conectividad funcional aumentaba en un subconjunto de estas neuronas (20). Al emparejar la fotoactivación holográfica de un conjunto conductualmente inespecífico con una recompensa conductual, se demostró que el animal podía aprender a asociar la activación del conjunto con el premio (3, 21, 22). Tales hallazgos sugieren que la optogenética holográfica de dos fotones podría usarse para reprogramar el cerebro y crear un vínculo artificial entre la actividad neuronal y los estados cognitivos. Este resultado tiene una enorme importancia traslacional y podría potencialmente usarse para restablecer las funciones cerebrales de una región dañada en una nueva región.

Los últimos 3 años han sido testigos de una nueva ola de hallazgos gracias a la optogenética holográfica de dos fotones en ratones despiertos. Se podría hacer mucho para aprovechar aún más su potencial, especialmente en la medicina traslacional. En nuestras demostraciones no invasivas, las neuronas diana se limitaron a las capas corticales. La capacidad de apuntar a regiones cerebrales profundas con un enfoque no invasivo o mínimamente invasivo ampliará enormemente su aplicación. El control de ciclo cerrado y en tiempo real de las imágenes, la optogenética y la monitorización del comportamiento podría potencialmente crear un nuevo tipo de interfaz cerebro-máquina. Como el primer tipo de modalidad de modulación cerebral precisa, imaginamos que la optogenética holográfica de dos fotones (15, 2327) seguirá desempeñando un papel fundamental tanto en la neurociencia fundamental como en la medicina traslacional.

Imagen incrustada

FOTO: CORTESÍA DE WEIJIAN YANG

FINALISTA

Weijian Yang

Weijian Yang recibió su licenciatura de la Universidad de Pekín y un doctorado de la Universidad de California, Berkeley. Después de completar su beca postdoctoral en la Universidad de Columbia, comenzó su laboratorio en el Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática de la Universidad de California, Davis en 2017. Su investigación tiene como objetivo desarrollar métodos ópticos avanzados y neurotecnologías para interrogar y modular la actividad cerebral, con un El objetivo es comprender cómo se organizan y funcionan los circuitos neuronales y cómo surgen los comportamientos de la actividad neuronal. www.sciencemag.org/content/373/6555/635